數值孔徑和分辨率

顯微鏡物鏡的數值孔徑是衡量其在固定物體（或標本）距離下工作時聚集光線和分辨精細標本細節的能力的指標。成像光波穿過標本并以倒置錐體的形式進入物鏡，如圖 1(a) 所示。白光由寬光譜的電磁波組成，其周期長度在 400 到 700 納米之間。作為參考，重要的是要知道 1 毫米等于 1000 微米，1 微米等于 1000 納米。綠色光的波長范圍以 550 納米為中心，相當于 0.55 微米。如果通過顯微鏡觀察小物體（例如安裝在顯微鏡載玻片上的典型染色標本），入射到這些微小物體上的光會發生衍射，從而偏離原始方向（圖 1(a)）。物體越小，入射光線的衍射就越明顯。數值孔徑越高，進入物鏡前透鏡的斜射線就越多，從而產生分辨率更高的圖像，使更小的結構更清晰地可視化。圖 1(a) 所示的是一個簡單的顯微鏡系統，由物鏡和樣本組成，樣本被準直光束照射，如果沒有使用聚光鏡，情況就是這樣。樣本衍射的光呈現為半角 () 的倒錐體，這代表可以進入物鏡的光的極限。為了增加顯微鏡的有效孔徑和分辨能力，添加了聚光鏡 (圖 1(b)) 以在樣本的照明側產生射線錐。這使物鏡能夠收集更大衍射角產生的光線，從而提高顯微鏡系統的分辨率。物鏡和聚光鏡的孔徑角之和稱為 工作孔徑。如果聚光鏡孔徑角與物鏡匹配，則可以獲得最大分辨率。

為了能夠比較兩個物鏡并獲得分辨率的定量控制，數值孔徑或物鏡覆蓋的立體角的測量值定義為：

其中α等于物鏡開角的一半，η是物鏡和保護標本的蓋玻片之間使用的浸沒介質的折射率（空氣為η=1;油或玻璃為η=1.5）。通過檢查上式，顯然折射率是實現大于 1.0 的數值孔徑的限制因素。因此，為了獲得更高的工作數值孔徑，必須增加物鏡前透鏡和標本蓋玻片之間介質的折射率。標準顯微鏡物鏡可獲得的最高孔徑角理論上為 180 度，因此數值孔徑公式中使用的半角值為 90 度。90 度的正弦等于1，這表明數值孔徑不僅受孔徑角限制，還受成像介質折射率限制。實際上，只有性能最高的物鏡才能達到超過 70 到 80 度的孔徑角，而這些物鏡通常要花費數千美元。

光學顯微鏡的分辨率定義為樣本上兩點之間的最小距離，該距離仍可區分為兩個獨立的實體。分辨率與顯微鏡的有效放大倍數和樣本細節的感知極限直接相關，盡管它在顯微鏡中是一個有點主觀的值，因為在高放大倍數下，圖像可能看起來不清晰，但仍可以最大程度地解析物鏡和輔助光學元件。由于光的波動性質以及與這些現象相關的衍射，顯微鏡物鏡的分辨率由能夠進入前透鏡的光波角度決定，因此該儀器被稱為衍射受限。這個限制純粹是理論上的，但即使是理論上理想的物鏡，沒有任何成像誤差，其分辨率也是有限的。
如果物鏡將細節投射到中間圖像平面上，其分辨率小于人眼的分辨率（這種情況在低放大倍數和高數值孔徑下很常見），觀察者將錯過圖像中的細微差別。如果圖像被放大到超出圖像的物理分辨率，就會出現空放大現象。出于這些原因，對觀察者來說，有用的放大倍數最好高于物鏡數值孔徑的 500 倍，但不能高于數值孔徑的1000倍。


提高顯微鏡光學分辨力的一種方法是在物鏡前透鏡和蓋玻片之間使用浸沒液。大多數放大倍數在 60 倍至 100 倍（及更高）之間的物鏡都設計用于浸沒油。使用折射率為η = 1.51 的油可獲得良好的效果，該折射率與玻璃的折射率精確匹配。通過這種方式可消除從物體到物鏡的路徑上的所有反射。如果不使用這個技巧，反射總是會導致蓋玻片或大角度情況下的前透鏡上的光線損失（圖 2）。

物鏡的有用數值孔徑以及分辨力會因上述反射而降低。物鏡的數值孔徑在一定程度上也取決于光學像差的校正量。高度校正的物鏡在相應放大倍數下往往具有更大的數值孔徑，如表 1 所示。

當來自標本各個點的光線穿過物鏡并重新組合成圖像時，標本的各個點在圖像中顯示為小圖案（不是點），稱為艾里斑。這種現象是由光線穿過標本中的微小部分和空間以及物鏡的圓形后孔時發生衍射或散射引起的。兩個小物體仍被視為獨立實體的極限被用作顯微鏡分辨能力的度量。達到此極限的距離稱為顯微鏡的有效分辨率，表示為d0。分辨率是一個可以根據儀器的光學參數和照明的平均波長從理論上推導的值。

首先，重要的是要知道，物鏡和筒鏡不會將物體上的一個點（例如，金屬箔上的一個微小孔）成像為具有清晰邊緣的明亮圓盤，而是成像為被衍射環包圍的略微模糊的點，稱為艾里斑（見圖 3(a)）。中間像平面附近的衍射圖案的三維表示稱為點擴展函數（圖 3(b)）。艾里斑是艾里圖案的第一個最小值所包圍的區域，包含約 84% 的光能，如圖 3(c) 所示。點擴展函數是艾里斑的三維表示。

分辨率可根據 19 世紀末恩斯特·阿貝 (Ernst Abbe) 提出的著名公式計算，該公式表示光學顯微鏡的圖像清晰度：

其中λ為光的波長， η表示如上所述的成像介質的折射率，組合項 η? SIN(α)稱為物鏡數值孔徑 (NA)。顯微鏡中常用的物鏡的數值孔徑小于 1.5，將上式中的項α限制為小于 70 度（盡管新的高性能物鏡非常接近此極限）。因此，當使用數值孔徑為 1.40 的物鏡時，最短實用波長（約 400 納米）的理論分辨率極限在橫向尺寸上約為 150 納米，在軸向尺寸上接近 400 納米。因此，使用顯微鏡無法在橫向平面上分辨距離小于此距離的結構。由于成像介質的折射率和物鏡的角孔徑之間的相互關系具有重要意義，Abbe 在解釋顯微鏡分辨率的過程中引入了數值孔徑的概念。

艾里斑中的衍射環是由物鏡孔徑的限制功能引起的，因此物鏡充當一個孔，衍射環位于其后。物鏡和聚光鏡的孔徑越大，d0就越小。因此，整個系統的數值孔徑越高，分辨率就越好。與原始阿貝公式相關的幾個方程式之一，用于表達數值孔徑、波長和分辨率之間的關系：

其中λ是光的成像波長， NAcon是聚光鏡數值孔徑，NA obj等于物鏡數值孔徑。系數 1.22 取自下圖中所示的兩個艾里斑接近時的計算結果，其中強度分布已疊加。如果兩個圖像點彼此相距較遠，則很容易將它們識別為單獨的物體。但是，當艾里斑之間的距離不斷減小時，當第二個艾里斑的主最大值與第一個艾里斑的第一個最小值重合時，就會達到極限點。疊加的分布顯示兩個亮度最大值，它們之間有一個谷值。谷底的強度與兩個極大值相比降低了約 20%。這剛好足以使人眼看到兩個獨立的點，這一極限被稱為瑞利判據。

比較一下可能有助于理解這一點。電話線不太可能用于小提琴微妙聲音的電子傳輸，因為這種介質的帶寬非常有限。如果使用高質量的麥克風和放大器，其頻率范圍與人類的聽覺范圍相同，則可以獲得更好的效果。在音樂中，信息包含在中等聲音頻率中；然而，聲音的細微差別包含在高泛音中。在顯微鏡中，結構的細微之處被編碼到衍射光中。如果您想在物鏡后面的成像空間中看到它們，您必須確保它們首先被物鏡收集。隨著孔徑角的增大和數值孔徑的增大，這變得更容易。
物鏡的數值孔徑隨著放大倍數的增加而增加，最高可達 40 倍（見表 1 和表 2），但對于油浸版本，數值孔徑在 1.30 和 1.40 之間穩定（取決于像差校正程度）。表 2 列出了研究和教學實驗室中常用物鏡的分辨率計算值。表中列出了樣本的點對點分辨率d0，以及中間目鏡平面（使用 550 納米波長的綠光）中圖像的放大尺寸 (D0)。此外，表中的n值表示如果它們沿 20 毫米的視場直徑排列成線性陣列（20/D0毫米），則解析像素的數量。

如果物鏡在低數值孔徑下無法提供足夠的像素，則不應嘗試使用提供高附加放大倍數（例如 16 倍、20 倍或 25 倍）的目鏡或其他光學后燃器來增加顯微鏡的整體放大倍數。另一方面，如果物鏡將非常精細的細節投射到中間圖像上，并且您使用的是放大倍數較低的目鏡，您將錯過細微的差別。為了在光學顯微鏡中觀察精細的標本細節，標本中存在的微小特征必須具有足夠的對比度，并以略大于人眼角分辨力的角度投射中間圖像。如前所述，顯微鏡的整體組合放大倍數（物鏡和目鏡）應高于 500 倍，但低于 1000 倍物鏡孔徑。該值稱為有用放大倍數的范圍。
在日常的常規觀察中，許多顯微鏡專家并不會嘗試用他們的設備實現盡可能高的圖像分辨率。顯微鏡的分辨率是光學系統最重要的特性，它會影響區分特定樣本精細細節的能力。決定分辨率的主要因素是物鏡數值孔徑，但分辨率還取決于樣本的類型、照明的相干性、像差校正程度以及其他因素，例如顯微鏡光學系統或樣本本身的對比度增強方法。

現代顯微鏡物鏡允許在實踐中實現理論分辨力，前提是觀察合適的標本。但是，有幾個提示可以確保成功。這些提示如下。

物鏡和標本是否干凈？空氣物鏡前透鏡上的指紋可能足以影響標本的高對比度圖像再現，這是由于不必要的散射光造成的。同樣的警告也適用于被樹脂或乳液殘留物（如油和水）弄臟的浸沒式物鏡。在這些情況下，使用軟布和鏡頭清潔劑或純乙醇仔細清潔物鏡前透鏡元件應該可以緩解問題。

蓋玻片的厚度是否正確？與高孔徑（大于 0.65）物鏡匹配的蓋玻片具有 170 微米的標準厚度至關重要，因為在設計物鏡時會考慮蓋玻片厚度。因此，如果使用不同厚度的蓋玻片（小于 165 微米或大于 175 微米），光學圖像的質量會明顯受到影響。一般來說，數值孔徑為 0.7 或更高的物鏡的經驗法則是，它們可以容忍 10 微米的變化，而數值孔徑較低的物鏡（0.3 到 0.7）可以容忍更高的偏差，通常高達 30 微米。

您使用的浸油正確嗎？ 所有數值孔徑大于 0.95 的物鏡都設計用于浸沒介質（通常為折射率為 1.515 的油）。浸油不含多氯聯苯，幾乎不顯示任何自發熒光。如果浸沒層中引入氣泡，圖像將明顯受損，因此必須小心涂油以避免產生氣泡。取下目鏡，通過顯微鏡觀察筒（或使用伯特蘭透鏡）檢查物鏡后焦平面，即可輕松看到氣泡。如果發現氣泡，應清潔物鏡和載玻片，并小心地重新涂上油。